Endonucleases אשר יזהה רצפי בסיס מסוים בתוך סליל DNA, יצירת כפול-סטרנד שוברים של ה-DNA.

הערה: מסוג I הגבלת אנזימים לאגד זיהוי אתרים אלה, אך לאחר מכן לגזור את ה-DNA באתרים שונים. אנזימי הגבלה type II לאגד, לגזור בתוך האתרים שלהם זיהוי או היעד.